DNA-Schleifen: Introns mit risikoassoziierten SNPs als Enhancer für benachbarte Autoimmun-Risikogene

Wie im letzten Beitrag angedeutet, wird durch die Daten des gigantischen ENCODE-Projekts (Encyclopedia of DNA Elements) und neue Techniken wie 3C (chromosome conformation capture), mit denen sich Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Teilen des Erbguts analysieren lassen, nun endlich klar, warum die bisherigen Versuche, Risikogene für Autoimmunerkrankungen dingfest zu machen, so bescheidene Ergebnisse erbracht haben. Jahrelang wurden mit Hilfe von genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) alle möglichen sogenannten Einzelnukleotid-Polymorphismen oder SNPs (single nucleotide polymorphisms) identifiziert, die irgendwie mit einem erhöhten Risiko verbunden waren, bestimmte Autoimmunerkrankungen zu bekommen. Manchmal lagen diese Hochrisiko-SNPs tatsächlich in oder direkt neben Genen, von denen man weiß, dass ihre Proteine etwas mit dem Immunsystem zu tun haben. Oft blieb der Zusammenhang aber völlig rätselhaft.

Jetzt zeigt sich: Man sollte immer auch untersuchen, ob die Sequenzen, in denen die SNPs liegen, womöglich gar keine Immunsystem-Proteine codieren, sondern als Steuerungselemente die Intensität der Ablesung anderer Gene in der weiteren Umgebung beeinflussen. Im Folgenden stelle ich eine Arbeit vor, in der auf diese Weise ein völlig neues Risikogen für Typ-1-Diabetes identifiziert wurde, dessen Funktion noch nicht bekannt ist. Die Autoren haben auch ein Modell entwickelt, das die „Fernwirkung“ der Sequenz mit den SNPs auf das Risikogen erklären kann.

Meine Notizen sind – wie immer – noch nicht allgemein verständlich aufbereitet.

Lucy J. Davison et al.: Long-range DNA looping and gene expression analyses identify DEXI as an autoimmune disease candidate gene. Human Molecular Genetics 21/2, 2012,  322-333; doi:10.1093/hmg/ddr468 (Open Access)  

Abstract: Die Chromosomenregion 16p13 ist mit mehreren Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht worden, darunter Typ-1-Diabetes (T1D) und Multiple Sklerose (MS). Die meisten mit den Erkrankungen assoziierten SNPs liegen im Gen CLEC16A. Doch die meisten dieser SNPs liegen im Intron 19 des Gens, das offenbar eine Steuerungssequenz enthält, die auf das benachbarte Gen DEXI einwirkt. [DEXI = Dexamethasone-induced, weil man das Protein erstmals nach entsprechender Behandlung bei Emphysempatienten nachgewiesen hat – nach neueren Erkenntnissen wohl eine irrtümliche Benennung, die hier weiter keine Rolle spielt.] Die Allele, die vor T1D und MS schützen, gehen mit einer verstärkten DEXI-Expression einher; die Expression anderer Gene der Region einschließlich CLEC16A wird nicht verändert. Mit der 3C-Technik wiesen die Autoren eine Wechselwirkung zwischen der DEXI-Promotorregion und dem Intron 19 von CLEC16A nach, zwischen denen eine DNA-Schleife von über 150.000 Basenpaaren (150 kb) liegt. Die Risiko-SNPs liegen in einem 20-kb-Fragment des Introns, das  spezifisch mit der DEXI-Promotorregion interagiert und die Expression steigert. Das Intron enthält zahlreiche Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und wirkt als Enhancer. DEXI ist also wohl ein neuer Kandidat für die genetische Basis von Autoimmunerkrankungen.

Einleitung: Die Region 16p13 des Humangenoms wurde mit T1D, MS, Nebennierenrindeninsuffizienz (Morbus Addison), Primär biliärer Zirrhose (PBC) und Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) in Verbindung gebracht, scheint also einen wichtigen Regulator von Autoimmunreaktionen zu enthalten. Sie wird vom dem großen (238 kb) Gen CLEC16A dominiert. Die SNPs, die am stärksten mit den Erkrankungen assoziiert sind, liegen in dem 60 kb großen Intron 19 und im Intron 10 dieses Gens. In derselben Region scheint es 3′ von CLEC16A ein weiteres mit T1D und Zöliakie assoziiertes Signal zu geben. CLEC16A gilt als potenzieller Verursacher, da es ein immunoreceptor tyrosine-based activation motive (ITAM) enthält und in vielen Immunzellen exprimiert wird. Es gibt aber etliche weitere Gene in der Region, die auch als Kandidatengene für T1D und/oder MS infrage kommen, darunter CIITA und SOCS1, sowie das Gen DEXI, dessen Funktion unbekannt ist. Die Autoren haben in den jüngst veröffentlichten ChIP-Seq-ENCODE-Daten nach Enhancern, Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und RNA-Polymerase-II-Bindungsstellen in der 16p13.13-Region gesucht, die Genexpression analysiert und danach in 3c-Experimenten nach Langstrecken-DNA-Interaktionen in der Region gesucht.

Ergebnisse: Daten aus normalen humanen Monozyten aus frischen Blutproben: Die DEXI-Expression korreliert mit etlichen SNPs in CLEC16A. Wegen des starken Kopplungsungleichgewichts (linkage disequilibrium) zwischen den SNPs konnte kein einzelner SNP identifiziert werden, der am stärksten mit der Expression korreliert. Zwischen der Expression von SOCS1, DEXI und CLEC16A war keine Korrelation festzustellen.

Die DEXI-Promotorregion und die am stärksten mit T1D assoziierten SNPs in CLEC16A sind durch etwa 160.000 Basenpaare getrennt. [Chromosom 16 ist insgesamt etwa 88,8 Mio. Basenpaare lang.] Vermutlich bildet die DNA  während der DEXI-Transkription eine Schleife aus, die beide Regionen miteinander in Verbindung bringt. Das lässt sich mit der 3C-Technik testen. Bei ihr entstehen durch chemische Vernetzung benachbarter DNA-Abschnitte in lebenden Zellen ligierte DNA-Fragmente. In allen drei getesteten Zelllinien wurde eine spezifische Assoziation zwischen dem DEXI-Promotor-Fragment und einem etwa 20 kb langen Fragment aus dem Intron 19 des Gens CLEC16A festgestellt. Mit den übrigen Kandidatengenen interagiert diese Intron-Region dagegen nicht. Innerhalb dieser Intron-19-Region liegt auch der SNP rs1272708716, der mehreren Studien zufolge am stärksten mit T1D und MS assoziiert ist.

Nichtcodierende DNA-Regionen können die Expression entfernt liegender Gene als Enhancer beeinflussen, wenn die DNA Schleifen bildet, sodass es zu proteinvermittelten Kontakten zwischen den beiden Regionen kommt. Viele Enhancer enthalten Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und epigenetische Histonmodifikationen (Methylierungen und Acetylierungen). Einige Enhancer in nichtcodierenden Genomabschnitten werden außerdem von RNA-Polymerase II transkribiert; die RNA hat regulatorische Funktion. Daher haben die Autoren die genomweiten ChIP-Seq-Daten des ENCODE-Projekts auf Histonmodifikationen und RNA-Polymerase-Bindungsstellen in der 16p13-Region durchsucht.

Im Intron 19 des Gens CLEC16A, insbesondere an dessen 3′-Ende, das mit dem DEXI-Promotor interagiert, fanden sich besonders viele dieser Enhancer-Markierungen. Die Sequenz ist zudem zwischen Mäusen und Menschen stark konserviert. Enhancer und Promotor haben etliche Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen gemeinsam, z. B. für NF-κB, JunD und c-Myc. Im Intron-19-Fragment gibt es auch eindeutige RNA-Polymerase-II-Bindungsstellen. Die biologische Funktion von DEXI ist unbekannt und sollte dringend erforscht werden, um seine Rolle bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen zu verstehen.

Diskussion: Früher hat man Genorte, die die Stärke der Expression von Genen beeinflussen (sog. eQTLs), nach dem Abstand zum Wirkungsort in cis (nah) und trans (fern, meist sogar auf einem anderen Chromosom) eingeteilt. Jetzt zeigt sich, dass es auch mittlere Entfernungen gibt. Hier wirkt der Enhancer z. B. auf das „übernächste“ Gen, das auf demselben Chromosom, aber über 150.000 Basenpaare entfernt liegt. Auch die anderen Gene der Region werden exprimiert; ihre Promotoren sind also ebenfalls zugänglich, werden aber von unserem Enhancer nicht beeinflusst. Wir haben es also mit einer spezifischen Wechselwirkung zu tun, die wohl über die Kombination mehrerer Transkriptionsfaktoren (und evtl. über regulatorische RNA) vermittelt wird. Außerdem ist an der Schleifenbildung in Chromosomen und der Regulierung der Genexpression durch Enhancer wohl die Rekrutierung von Cohesin und dem aus vielen Proteinen bestehenden Mediator-Komplex beteiligt. Hypothese: Mutationen im Intron 19 beeinflussen die Chromatinstruktur und/oder die Rekrutierung der Proteine für den Transkriptions-Koaktivierungskomplex und damit die Enhancer-Aktivität.

[Dazu Modell in Abb. 4: Die T1D-assoziierten SNPs innerhalb der DNA-Schleife zwischen Enhancer und DEXI-Promotor beeinflussen die Genexpression, indem sie die Bindung von Transkriptionsfaktoren und anderen Proteinen an oder in der Nähe von der Interaktionsstelle in Intron 19 verändern. Schützende Allele in 16p13 -> effizienterer Transkriptionskomplex -> stärkere DEXI-Expression. Denkbar ist stattdessen auch eine reduzierte Bindung von Suppressoren bzw. Silencer-Proteinen. Risiko-Allele -> entsprechend schwächere Enhancerwirkung (oder stärkere Suppression) -> schwächere DEXI-Expression.]

Monozyten sind an der Pathogenese von T1D beteiligt; aus ihnen entstehen Makrophagen und dendritische Zellen, die am Priming der Langerhans-Inseln und der Entstehung eines entzündlichen Milieus vor der Zerstörung der Inseln durch antigenspezifische T-Zellen beteiligt sind. Während MS-Schüben dringen T-Zellen und Makrophagen ins ZNS ein und bilden Infiltrate rings um die Blutgefäße, was mit einer Schwächung der Blut-Hirn-Schranke einhergeht. Allerdings ist die DEXI-Expression in CD4+- und NK-Zellen offenbar stärker als in Monozyten. Evtl. spielt DEXI für Autoimmunerkrankungen also nicht (nur) in Monozyten, sondern (auch) in anderen Zellen (des Immunsystems) eine Rolle, oder es ist nur in einem bestimmten Entwicklungsstadium wichtig. In Makrophagen ist die DEXI-Expression offenbar stärker als in ruhenden Monozyten.

Das DEXI-Gen ist in vielen Arten wie Maus, Ratte, Hund, Elefant, Zebrafisch und Huhn konserviert, aber im Fadenwurm Caenorhabditis elegans oder in der Taufliege Drosphila findet es sich nicht. Einige (aber nicht alle) Softwarepakete ordnen ihm eine Transmembrandomäne und eine Sequenz mit einem Leucin-Wiederholungsmotiv und eine mutmaßliche Caseinkinase-Phosphorylierungsfunktion zu. Es wird offenbar in der Leber, dem Gehirn, dem Herzen und der Lunge sowie in einigen Immunzellen am stärksten exprimiert. Die Expression soll durch Rauchen beeinflusst werden. Das Gen enthält microRNA-Bindungsstellen und könnte daher auch durch microRNAs reguliert werden.

Die vorliegende Studie ist die erste, in der durch GWAS identifizierte AIE-Risiko-SNPs, die in einem Intron liegen, offenbar die Expression eines Nachbargens beeinflussen.

[Skizzen folgen demnächst.]

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