The Epigenetics of Autoimmune Diseases, Kap. 1: Transkriptionsregulierung der T-Zell-Toleranz

Notizen zum 1. Kapitel des Buches von Moncef Zouali (Hg.), Autoren: Brian T. Abe et al.; noch nicht allgemein verständlich aufbereitet

Einführung

Im Körper entstehen gelegentlich Lymphozyten (T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen; Untergruppe der Leukozyten), die auf körpereigenes Gewebe reagieren. Diese Selbstreaktivität kann zu Autoimmunkrankheiten führen. Ihre Eindämmung erfolgt auf zwei Ebenen: zentrale und periphere Toleranz. Sowohl selbstreaktive B-Zellen als auch selbstreaktive T-Zellen können eliminiert oder tolerant gemacht werden. Schwerpunkt dieses Kapitels sind die T-Zellen.  

T-Zell-Vorläufer wandern aus dem Knochenmark in den Thymus, wo sie von Thymozyten zu Lymphozyten heranreifen. Thymozyten mit Antigen-Rezeptoren, die stark an die von den epithelischen und dendritischen Thymuszellen präsentierten Selbst-Antigene binden, also selbstreaktiv sind, werden ausgesondert und dem programmierten Zelltod (Apoptose) überantwortet (zentrale Toleranz). Dennoch entkommen einige reife T-Zellen, die selbstreaktive T-Zell-Rezeptoren tragen, in die Peripherie. Dort beschränken sowohl zelleigene Mechanismen (Anergie) als auch äußere Faktoren (regulatorische T-Zellen) die Aktivierung der T-Zellen gegen Selbst-Antigene (periphere Toleranz).

T-Zell-Anergie

Anergie ist ein Inaktivierungsmechanismus in T-Zellen, die zwar vom Haupthistokompatibilitätskomplex einer antigenpräsentierenden Zelle ein passendes Antigen präsentiert bekommen, nicht aber das ebenfalls nötige kostimulierende Signal. Dann wird zwar am T-Zell-Rezeptor, der Kontakt zum Antigen hat, eine Signalkaskade ausgelöst, nicht aber am Rezeptorprotein CD28, das keinen Kontakt zum kostimulierenden Molekül B7 hat. Das führt zu hyporesponsiven T-Zell-Klonen, die kein Interleukin-2 herstellen und sich nicht richtig vermehren können. Stattdessen werden bei einer solchen unvollständigen Aktivierung andere Gene transkribiert, die die klonale Anergie aufrecht erhalten.

Tierversuche zeigten, dass eine Voraktivierung der T-Zellen notwendige Voraussetzung für die Etablierung des hyporesponsiven Zustands ist. Offenbar gibt es verschiedene Grade der Unempfänglichkeit der T-Zellen. Unter bestimmten Versuchsbedingungen halten der Wachstumsstopp der voraktivierten T-Zellen und die schweren Störungen der Produktion von IL-2 und anderen Zytokinen zwar lange an, aber diese Unempfänglichkeit für das Antigen kann durch IL-2-Gaben aufgehoben werden. Hingegen sind adaptiv tolerant gemachte T-Zellen zwar ebenfalls hyporesponsiv, aber dieser Zustand ist nicht durch IL-2-Gaben behebbar, und er hält nur so lange an, wie die Zellen dem Antigen ausgesetzt sind. An der Auslösung adaptiver Toleranz könnte das zytotoxische T-Zell-Lymphozyten-Antigen 4 (CTLA-4) beteiligt sein: Seine Blockade verhindert die Induktion von T-Zell-Anergie, und auch in CTLA-4-/--T-Zellen lässt sich keine Toleranz induzieren. Auch Adenosin spielt bei der Steuerung der peripheren Toleranz offenbar eine wichtige Rolle: Bei einem anergetisierenden Stimulus verstärken T-Zellen die Expression des Adenosinrezeptors A2A. Wird der Rezeptor von freiem Adenosin besetzt, so wird der Ras/MAPK-Signalweg blockiert, und die T-Zellen werden anergisch. (Ras = rat sarcoma, ein kleines G-Protein, das für viele Signaltransduktionswege wichtig ist; MAPK = mitogen-aktivierte Proteinkinase)

Der Ca2+-Calcineurin-NFAT-Signalweg

Die Zelladhäsionsmoleküle LFA-1 (Lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen 1) und ICAM-1 (interzelluläres Zelladhäsionsmolekül 1) bilden eine stabile Brücke zwischen dem T-Zell-Rezeptor (TCR) einer T-Zelle und dem passend beladenen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) einer antigenpräsentierenden Zelle; dies ist das Signal 1. Außerdem ist ein Kostimulationssignal (Signal 2) nötig, um die T-Zelle richtig zu aktivieren. Unter den kostimulierenden Rezeptor-Liganden-Paaren ist CD28-B7.1/B7.2 am besten charakterisiert. Deren Wechselwirkung polarisiert die T-Zelle und führt zur Ausbildung einer immunologischen Synapse mit einer hohen Dichte an TCR-MHC- und kostimulierenden Rezeptor-Liganden-Paaren. Die Fortpflanzung dieses Signals löst innerzelluläre Vorgänge aus, die die T-Zelle aktivieren, also zur Vermehrung und Zytokinherstellung führen:

Durch die Stimulation des TCR wird die membrangebundene Phospholipase Cγ (PLC-γ) aktiviert, die Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat zu Inositol-3-Phosphat und Diacylglycerol (DAG) spaltet. Beide Reaktionsprodukte dienen als Signale: Inositol-3-Phosphat erhöht die zytoplasmatische Calciumkonzentration, indem es das Endoplasmatische Reticulum zur Leerung seiner Depots veranlasst. Daraufhin öffnen sich calciumaktivierte Kanäle in der Plasmamembran, sodass auch extrazelluläres Calcium einströmt und den Calciumspiegel hoch hält. Das Protein Calmodulin aktiviert, sobald es Calcium bindet, die Phosphatase Calcineurin, die wiederum Transkriptionsfaktoren aus der NFAT-Familie (nucleated factor of activated T cells) dephosphoryliert. Diese wandern daraufhin in den Kern und fördern dort im Verbund mit weiteren Transkriptionsfaktoren die Expression eines Transkriptionsprogramms, zu dem viele Zytokin-Gene gehören. Transkriptionsfaktoren der NFAT-Familie werden in zahlreichen Geweben exprimiert. NFAT1 bis 4 werden über die gerade beschriebenen Calciumströme durch Calcineurin reguliert, das entfernt verwandte NFAT5 durch osmotischen Stress. Bei Dephosphorylierung wird in den calcineurinregulierten NFATs ein Signal zur Verortung im Kern exponiert, durch das sie sich in den Kern verlagern. Dort interagieren sie mit weiteren Transkriptionsfaktoren, darunter den Aktivatorprotein-1-Komplexen (AP-1). So wird in aktivierten T-Zellen die Expression vieler Zytokine ausgelöst.

Zu klonaler Anergie kommt es, wenn die T-Zell-Rezeptoren in Abwesenheit kostimulierender Signale stimuliert werden. Dann verlagern sich die NFAT-Proteine  zwar in den Kern, aber es entstehen keine funktionstüchtigen AP-1-Komplexe, da der Ras/MAPK-Weg bei fehlender Kostimulation nicht aktiviert wird und sich die Fos- und Jun-Heterodimere infolgedessen nicht zu AP-1-Komplexen zusammenlagern. Ohne die AP-1-Kooperation induziert NFAT1 die Expression von Genen für negative Regulatoren der T-Zell-Aktivierung (siehe nächster Abschnitt). Diese anergieassoziierten Gene bewirken unter anderem eine epigenetische Modifikation des IL-2-Promoters, die eine Expression dieses Gens verhindert (Silencing; siehe übernächster Abschnitt).

Das Transkriptionsprogramm der T-Zell-Anergie

T-Zell-Anergie ist ein aktiver Vorgang mit einem besonderen Transkriptionsprofil. Ohne eine calcineurinvermittelte Aktivierung der NFAT-Proteine beispielsweise kommt keine Anergie zustande. Die Expression einer daueraktiven Form von NFAT1 induziert die Expression etlicher anergieassoziierter Gene. Vermutlich sorgen NFAT1-Homodimere für die Transkription von Genen, die am Erhalt des hyporesponsiven Zustands beteiligt sind.

Auch die Transkriptionsfaktoren Egr2 und Egr3 (early growth response) sind offenbar zur Anergie-Induktion nötig. Sie werden bevorzugt in anergischen T-Zellen exprimiert und scheinen die TCR-Signalgebung in anergischen Zellen herunterzuregeln. Die Expression von Egr2 und Egr3 könnte durch NFAT-Aktivierung nach einem anergisierenden Reiz zustandekommen; die Transkriptionsfaktoren würden dann ihrerseits die Expression weiterer anergieinduzierender Gene aktivieren, z. B. Cbl-b (siehe übernächster Absatz).

Anergische T-Zellen regeln also die Expression von Genen hoch, die beispielsweise durch den Abbau oder die Inaktivierung zentraler Signalmoleküle die normale TCR-Signalkaskade blockieren.

Die Expression des GRAIL-Genprodukts (gene related to anergy in lymphocytes), eines Transmembran-RING-Fingerproteins, wird in T-Zell-Klonen, die in Abwesenheit einer Kostimulation mit einem peptidbeladenen MHC stimuliert werden, calcium- und calcineurinabhängig stark hochgeregelt. GRAIL fungiert als E3-Ubiquitin-Ligase und kann bei starker Expression die IL-2-Produktion und die T-Zell-Proliferation stoppen. Es scheint für den Aufbau der peripheren T-Zell-Toleranz notwendig zu sein, denn ein verstärkter GRAIL-Abbau behindert die Induktion von T-Zell-Anergie. Zielsubstrat für die Ubiquitinierung durch GRAIL ist offenbar ein Rho-Guanin-Dissoziationsinhibitor, RhoGDI. Die Ubiquitinierung stabilisiert diesen Inhibitor, der GTPasen der Rho-Familie von der Membran fernhält (Sequestrierung), sodass sie das Zytoskelett nicht umorganisieren können.

Auch Cbl-b, ein Mitglied der Casitas-B-Lymphom-Proteinfamilie, wird in anergischen T-Zellen exprimiert und trägt zum Erhalt der Anergie bei. Diese RING-Finger-enthaltende E3-Ubiquitin-Ligase ist an der negativen Regulierung von TCR- und weiteren Signalwegen beteiligt. Wie erwähnt aktivieren Egr-Proteine die Cbl-b-Expression in anergischen T-Zellen. Cbl-b ubiquitiniert die p85-Untereinheit der Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K). Dadurch verlagert sich die Untereinheit von der immunologischen Synapse ins Innere der Zelle, sodass die PI3K nicht mehr mit CD28 und der TCR-ζ-Kette in Verbindung treten kann. Cbl-b kann auch den Phosphorylierungsgrad des Adaptormoleküls Vav1 und damit seine Verfügbarkeit für die immunologische Synapse beeinflussen. Das Protein scheint eine Schlüsselrolle für die periphere Toleranz zu spielen, denn Cbl-b-defiziente Mäuse entwickeln Autoimmunkrankheiten, und in ihren T-Zellen kann keine Anergie induziert werden: Trotz anergisierender Reize wird die PLC-γ nicht richtig inaktiviert.

Itch ist ein Zytosol-Protein mit einer HECT-Domäne (homologue to E6AP C-terminus), die ihm ebenfalls E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität verleiht. Wie bei Cbl-b und GRAIL wird die Itch-Expression bei einer Anergieinduktion auf dem Calcium-Calcineurin-NFAT-Weg erhöht. Werden anergische T-Zellen erneut stimuliert, verlagert sich Itch in Membranmikrodomänen, in denen es PLC-γ sowie die Proteinkinase C θ einfach ubiquitiniert, was den Abbau beider Enzyme in Lysosomen fördert. Der Enzymabbau führt zur Blockade des Calciumflusses und unterbricht Signalwege, die für die Bildung der immunologischen Synapse zentral sind. Außerdem ubiquitiniert Itch auch Jun, was ebenfalls die Expression von IL-2 hemmen dürfte. Itch-defiziente Mäuse bilden eine schwere Lymphoproliferative Erkrankung aus, haben große sekundäre Lymphknotenorgane, chronische Entzündungen und juckende Haut – daher der Name.

Auch die Expression der Diacylglycerinkinase-α (DGK-α) wird während der T-Zell-Anergie-Induktion hochgeregelt. DGK-α phosphoryliert DAG (Diacylglycerin), das zu Phosphatidsäure umgewandelt wird. Der Mangel an DAG verhindert die Rekrutierung des Guaninnukleotid-Austauschfaktors RasGRP1 und führt dazu, dass ein Signal am TCR nicht in eine Ras-Aktivierung mündet. Eine pharmakologische Inhibition von DGK-α lässt in anergischen Zellen die IL-2-Produktion wieder anspringen, und DGK-α-defiziente Mäuse haben hyperresponsive T-Zellen, in denen sich keine Anergie induzieren lässt.

Die Expression von Caspase 3 ist während der T-Zell-Anergie ebenfalls erhöht. Diese Protease wird in nicht apoptotischen anergischen T-Zellen anschließend aktiviert und lagert sich dann an die Plasmamembran an, wo sie nach einer Reaktivierung des TCR GADS [Grb2-related adaptor downstream of shc] und Vav1 spaltet und inaktiviert.

Transkriptionelle Repression bei der T-Zell-Anergie: Epigenetische Modifikation des Il2-Promoters

In anergischen T-Zellen wird der Ras/MAPK-Signalweg und damit der AP-1-Komplex nicht richtig aktiviert, was zu einer verringerten IL-2-Produktion und damit zu Hyporesponsivität führt. Im letzten Abschnitt wurde erläutert, wie eine Reihe von vermehrt exprimierten Proteinen die TCR-Signalgebung stören kann. Darüber hinaus scheint es eine aktive transkriptionelle Repression zu geben; die Zytokintranskription wird also auch direkt inhibiert. Regionen im Il2-Promoter binden an Repressorkomplexe, die den Il2-Promoter inaktivieren.

In T-Zellen wird die Expression des Il2-Gens durch aktive Chromatin-Remodellierung des Genorts gesteuert. In naiven T-Zellen ist der distale Il2-Promoter so weit offen, dass das Zytokin schwach exprimiert werden kann. Nach der T-Zell-Aktivierung wird der Il2-Promoter remodelliert: Er wird zugänglicher für Nukleasen, und die Histone werden stärker acetyliert. Für die Histonacetylierung ist ein Signal nötig , an dem CD28 beteiligt ist. So kommt es in in Effektor-T-Zellen zu einer stärkeren IL-2-Expression.

In anergischen T-Zellen wird die Transkription hingegen infolge epigenetischer Modifikationen aufgrund toleranzinduzierender Reize unterdrückt: Bei unvollständiger Stimulation, die eine T-Zell-Anergie auslöst, wird die Ikaros-Expression hochgeregelt. Ikaros gehört zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, die für die Lymphentwicklung notwendig sind, und vermittelt in anergischen T-Zellen die transkriptionelle Repression, indem es direkt an den Il2-Promoter bindet und Histon-Deacetylasen (HDACs) rekrutiert. Die darauf folgende Deacetylierung der Histone H3 und H4 hält den Il2-Promoter geschlossen und verhindert die Transkription des Zytokins.

Die Aktivierung der Il2-Transkription wurde auch mit Änderungen im DNA-Methylierungsgrad des Il2-Promoters in Verbindung gebracht: Ein TCR-Signal führt zur Demethylierung der Il2-Promoter-/Enhancer-Region in Effektor-T-Zellen, und die verringerte Produktion von IL-2 und Interferon-γ in anergischen T-Zellen geht mit einer stärkeren DNA-Methylierung in diesen Genen einher.

Diese Indizien sprechen dafür, dass T-Zellen anergisch werden, wenn bestimmte Stimuli ein Programm aktiver epigenetischer Modifikationen anstoßen, die das Zytokinexpressionsmuster in diesen T-Zell-Populationen verändern.

Regulatorische T-Zellen

Die Suppression durch die in den 1970er-Jahren entdeckten regulatorischen T-Zellen (Tregs) ist ein Mechanismus der peripheren Toleranz, der selbstreaktive Lymphozyten daran hindert, schädliche Autoimmunantworten auszulösen. CD25, die α-Kette des IL-2-Rezeptors, eignet sich als Marker zur Beobachtung suppressiver CD4+-T-Zellen. Im Tierversuch lassen sich Autoimmunerkrankungen durch die Übertragung solcher CD25+-Zellen aus adulten Mäusen verhindern. Es gibt mehrere Treg-Untertypen: Natürliche (angeborene) CD4+-CD25+-Tregs entwickeln sich im Thymus und stellen etwa 2-10 % aller CD4+-T-Zellen; in der Peripherie entstehen adaptiv weitere Populationen. Wie sich natürliche und adaptive Tregs entwickeln und wie sie zur Suppression führen, ist noch nicht hinreichend aufgeklärt. Das wäre für die Entwicklung neuer Therapien gegen Autoimmunkrankheiten wichtig.

Transkriptionskontrolle der Treg-Entwicklung und -Funktion

Der Transkriptionsfaktor Foxp3, dessen Gen auf dem X-Chromosom liegt, ist für die Entwicklung von Tregs im Thymus und den Erhalt ihrer Regulierungsfunktion in der Peripherie nötig. Welche Signale seine Expression regulieren, ist noch unklar; in Tregs fallen aber CpG-Demethylierungen und Histonmodifikationen in der FoxP3-Promoter-Region auf, die mit einer aktiven Transkription assoziiert sind. Der Promoter enthält auch ein konserviertes Enhancer-Element, das in Tregs einen hohen Grad an H4-Acetylierung aufweist und synergistisch durch die Transkriptionsfaktoren Smad3 und NFAT aktiviert wird.

Der Transkriptionsfaktor Foxp3 ist offenbar nicht nur zur Treg-Entwicklung nötig, sondern muss auch ständig exprimiert werden, um deren Regulationsfähigkeit zu erhalten.

Der Vergleich der Expressionsprofile von nichtregulatorischen und regulatorischen T-Zellen offenbart zwei Gruppen von Genen, deren Expression durch Foxp3 reguliert wird: solche für Proteine, die an der Regulierung der T-Zell-Aktivierung und der TCR-Signalgebung beteiligt sind, und solche, deren Proteine die Transkription regulieren, darunter mehrere Transkriptionsfaktoren und Proteine, die an der Chromatin-Modifikation beteiligt sind. Auf viele der Zielgene wirkt Foxp3 als Repressor, aber die Expression einiger Gene kann es auch aktivieren. Offenbar wirkt es weniger direkt durch Bindung an die Promotoren seiner Zielgene als vielmehr indirekt: durch die Expression anderer Transkriptionsfaktoren, die wiederum das Treg-spezifische Genexpressionsprogramm regulieren.

Das Foxp3-induzierte Expressionsprogramm für die Treg-Differenzierung und -Funktion wird in den Thymozyten etabliert und epigenetisch in peripheren Tregs aufrecht erhalten. Tregs können das Chromatin am Il2-Promoter nicht remodellieren, sodass er nicht abgelesen werden kann. Die Ursache dieser Transkriptionssuppression sind chromatinmodifizierende Enzyme, die in der Gegenwart von Foxp3 die Histone am Il2-Promotor deacetylieren. Foxp3 gehört zu einem Komplex, der die Histon-Deacetylasen HDAC7 und 9 sowie die Histon-Acetltransefrase TIP60 umfasst, die alle für die Foxp3-regulierte Aktivierung bzw. Suppression der Transkription von Genen nötig sind. Die Stärke der Bindung an den Il2-Promoter könnte durch die Acetylierung von Foxp3 reguliert sein.

An welchen unterschiedlichen Transkriptionskomplexen Foxp3 beteiligt ist, muss noch aufgeklärt werden. Vielleicht konkurriert Foxp3 mit den NFAT-AP-1-Komplexen um die Regulationselemente von Il2. Die Kristallstrukturen deutet darauf hin, dass NFAT und Foxp3 kooperativ an DNA binden. NFAT und Foxp3 können in Tregs die Il2-, Il2ra– und Ctla4-Promotoren besetzen. Eine Foxp3-Mutation, die die Wechselwirkung mit NFAT verhindert, kann keinen suppressiven Phänotyp ausbilden. Das zeigt, dass NFAT-Proteine eine Schlüsselrolle bei der Regulation des T-Zell-Schicksals spielen, indem sie Signale, die von den TCR kommen, mit Signalen aus der Beteiligung weiterer Rezeptoren wie CD28 oder dem TGF-β-Rezeptor verschalten. Je nachdem, welche Transkriptionspartner zur Verfügung stehen, werden unterschiedliche Signalwege beschritten: Wenn NFAT mit AP-1 kooperiert, werden die T-Zellen aktiviert; wenn NFAT mit Foxp3 kooperiert, differenzieren sie sich zu Tregs aus; findet NFAT gar kein Transkriptionspartner, werden sie anergisch.

Transkriptionsmechanismen könnten nicht nur die Treg-Differenzierung regulieren, sondern auch der Suppression der T-Zell-Aktivierung durch Tregs zugrunde liegen. T-Zellen, denen zwei Mitglieder der NFAT-Familie (NFAT1 und NFAT4) fehlen, können nämlich von kompetenten Tregs nicht supprimiert werden. Diese kombinierte NFAT-Defizienz lässt zwar eine normale Entwicklung der Tregs zu, kann aber dennoch einen Autoimmun-Phänotyp ausbilden. Also müssen Zellen, die durch Tregs supprimiert werden sollen, wohl NFAT enthalten, das in ihnen die Expression spezifischer Gene steuert, die die T-Zell-Aktivierung verhindern können.

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